Please use this identifier to cite or link to this item: https://hdl.handle.net/20.500.13087/2475
Title: İnsan gen terapötiklerinden interferon beta (hIFN?)'nın Tetrahymena thermophila'da rekombinant üretimi ve karakterizasyonu
Other Titles: Recombinant production and characterisation of human interferon beta (hIFN?) therapeutic protein in Tetrahymena thermophila
Authors: Arslanyolu, Muhittin
Kaya, Murat
Keywords: Biyoloji
Biology
Biyomühendislik
Bioengineering
Biyoteknoloji
Biotechnology
DNA-rekombinant
DNA-recombinant
Issue Date: 2019
Publisher: Eskişehir Teknik Üniversitesi
Abstract: Sağlık ve Biyoteknoloji araştırmalarında alternatif protein üretim konakçısı olarak kullanılmakta olan silli tekhücreli Tetrahymena thermophila ucuz ve kolay kültüre edilebilmektedir. Anti-kanser monoklonal (rituximab) antikoru, bu organizmada en son üretilen gen törapotiğidir. T. thermophila ürettiği proteinlere disülfit bağları ile insanınkine benzer küçük yapılı glikozilasyon çatalı eklemesiyle E. coli' den farklılaşmaktadır. Multiple Skleroz (MS) oto-immün hastalığının tedavisinde kullanılan insan interferon beta (IFN?) terapötik proteinin T. thermophila'da rekombinant üretimi, bu tez çalışmasının amacını oluşturmaktadır. T. thermophila'ya kodon optimizasyonu gerçekleştirilen hIFN?'nin dizisine, füzyon proteinin C-ucunda sfGFP ve 12xHis afinitik saflaştırma takısı olacak şekilde kodlayıcı diziler eklenerek oluşturulan okuma çerçevesi, kadmiyum ile indüklenen MTT1 promotoru kontrolü altına klonlanmıştır. Floresan mikroskop, SDS-PAGE ve Western blot analizleri, 48 kDa'luk Tt-hIFN?-TtsfGFP-12xHis füzyon proteini ile 20 kDa'luk kırılmış Tt-hIFN?'yı T. thermophila' nın rekombinant protein olarak ürettiğini işaret etmektedir. Afinitik takısız ve GFP'siz hücre dışına salgılatılabilen Tt-hIFN? kodlayıcı dizi ısışoku promotoru altında gen kaseti olarak TtAC2 yapay kromozom vektörüne klonlanmıştır. Transformasyon ve antibiyotik seleksiyonu ile pozitif tek hücre klon izolasyonu gerçekleştirilmiş ve protein saflaştırma ile aktivite analizlerine geçilmiştir.
Unicellular eukaryotic ciliate Tetrahymena thermophila with its cheap and simple culturing is used in health and biotechnological studies as alternative protein production host factory. Recently, anti-cancer monoclonal antibody (rituximab) drug has been produced as recombinant protein in this organism. T. thermophila is able to add correct disulfide bonds and form human-like small-size glycosylation modifications whereas E. coli could not. The capacitive analysis of T. thermophila to produce recombinant human interferon beta therapeutic protein which is used in treatment of Multiple Sclerosis (MS) auto-immune disease is the aim of this thesis. Synthesized according to the frequency of codon usage in Tetrahymena codon-optimised hIFN? sequence, coding sequences of sfGFP and 12xHis affinity tag in its C-terminal position of hIFN?-TtsfGFP cassette were placed and the fusion protein coding ORF was cloned into the pVGF vector under the control of cadmium inducible MTT1 promoter. Confirmation of the production of 48 kDa Tt-hIFN?-TtsfGFP-12xHis fusion protein and 20 kDa broken Tt-hIFN? by fluorescence microscopy and Western Blot analysis has showed that hIFN? was successfully produced in T. thermophila as recombinant protein. Affinitic and GFP tag-free Tt-hIFN? gene coding cassette with extracellular secrotary sequence was also placed under the heatshock promotor in the TtAC2 artificial chromosome vector. After the transformation of this vector into Tetrahymena cells, antibiotic selection and positive single cell clon isolation has been completed.
URI: https://hdl.handle.net/20.500.13087/2475
https://tez.yok.gov.tr/UlusalTezMerkezi/TezGoster?key=vjszP7PzV0HebcjFEvDfwNdlGlsPTCD9uj9go8oe_Fft7M7Hd_AuyaqyTBy_UGXm
Appears in Collections:Tez Koleksiyonu

Show full item record

CORE Recommender

Page view(s)

88
checked on Oct 3, 2022

Google ScholarTM

Check


Items in GCRIS Repository are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.